Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt Karlsruhe
Lebensmittelüberwachung und Tiergesundheit im Regierungsbezirk Karlsruhe
Semiquantitative Bestimmung von beta-Carotin in Rinderseren
Es wird ein photometrisches Verfahren zur semiquantitativen Bestimmung von beta-Carotin in 96-well Flachboden-Mikrotiterplatten vorgestellt.
Neben seiner Eigenschaft als Vorstufe von Vitamin A wird beta-Carotin beim Rind die Eigenwirkung als ein die Fruchtbarkeit beeinflussender, fütterungsabhängiger Faktor zugesprochen.
Die Bestimmung des beta-Carotin-Gehaltes im Blutserum wird zumeist durch einfachen optischen Vergleich des Serums mit einer Farbskala durchgeführt. Dabei sind abhängig von Betrachter, Lichteinfall und Hämolyse der Proben Unterschiede bei den ermittelten Werten möglich. Um diese Faktoren möglichst zu eliminieren und das Verfahren zu standardisieren, haben wir versucht, ein photometrisches Verfahren zur semiquantitativen Bestimmung von beta-Carotin im Serum zu erarbeiten. beta-Carotin und andere Carotinoide haben in farblosen organischen Lösungsmitteln (z.B. n-Heptan) ihr Absorptionsmaximum bei 450 nm. Das Absorptionsmaximum von Hämoglobin in wässriger Lösung liegt bei 550 nm. Somit sollte die Messung mit 450 nm gegen einen Referenzfilter von 550 nm auch die Auswertung leicht hämolytischer Seren ermöglichen. Dazu wurde folgender Ansatz gewählt:
- Messung nicht in Küvetten, sondern in der 96-well Flachboden- Mikrotiterplatten. Grund: Einfachere Messung von Serien. Füllmenge: 350 µl/well.
- Ein geeignetes organisches Lösungsmittel mit gutem Lösungsvermögen für beta-Carotin und geringer Verdunstungsrate bei Zimmertemperatur dient als Null-Standard. Dazu wurde Paraffinöl (FLUKA NR. 76233) verwendet.
- Ein Standard am oberen Rand des physiologisch zu erwartenden Bereiches mit ca. 1.000 µg/100 ml dient zur Erstellung einer Eichgeraden. Dieser Standard wird mittels HPLC überprüft.
- Mehrfachmessungen von Standard und Seren dienen zur Ermittlung von Standardabweichung und Variationskoeffizient.
- Messungen von Wasser und Lösungsmittel zur Ermittlung einer evtl. erforderlichen Korrektur.
Zur Überprüfung des Verfahrens werden anschließend einige Seren zusätzlich mittels HPLC untersucht.
Verwendete Hard - und Software:
- Filter-Photometer SLT SPECTRA CLASSIC,
- PC mit Auswertungssoftware Easy-Fit von SLT.
Die Messung von Rinderseren mit dem beschriebenen Verfahren liefert bei guter Reproduzierbarkeit und Präzision (VK ca. 5%) Werte im bisher festgestellten Bereich, ohne die genannten Einflussfaktoren der optischen Bewertung durch einfachen Farbvergleich. Nullstandard und Standard sind unter Lichtabschluss und kühler Lagerung zumindest einige Wochen haltbar. Die Mitführung der Standards bei laufenden Messungen kann entfallen, wenn die Auswertungssoftware die Speicherung der Messwerte von Bezugsstandards erlaubt.
Weitere Messungen von Proben aus Beständen mit ausreichender (Grünfutter) bzw. nicht ausreichender Versorgung über das Futter (z.B. alte Silage) sollen zeigen, ob die bislang ermittelten Werte zur Abgrenzung des physiologischen Bereiches, abhängig von der Fütterung, auch für dieses Verfahren zutreffen.
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